Figura 3.1. Estrutura da Endotoxina LPS (Lipopolissacarídeo). (National Center for Biotechnology Information (2020). PubChem Compound Summary for CID 53481794, LPS core. Retrieved August 19, 2020 from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/LPS-core.)
Figura 3.2 Estrutura dimérica do TLR-4 (azul) associado a proteína M2 (laranja) e LPS (sticks). Estrutura de raio X visualizada no Chimera a partir do arquivo 3fxi.pdb (Park BS, Song DH, Kim HM, Choi BS, Lee H, Lee JO. The structural basis of lipo- polysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex. Nature. 2009; 458(7242): 1191-1195. doi:10.1038/nature07830).
Receptores de reconhecimento da defesa Inata
Como o hospedeiro percebe os patógenos? Os conceitos recentes têm sua origem em pesquisas científicas para entender as doenças infecciosas: como os patógenos prejudicam o hospedeiro, quais moléculas são detectadas e, em última análise, a natureza dos receptores que o hospedeiro usa. A descoberta de sensores do hospedeiro - os receptores Toll-like (TLR) foi baseada em análises químicas, biológicas e genéticas que se centraram em uma toxina bacteriana, denominado endotoxina.
A defesa inata possui um repertório limitado de receptores para reconhecimento de endotoxinas ou antígenos associados a patógenos. As células apresentadoras de antígenos (APCs) expressam além de receptores TLRs, receptores de manose e receptores de peptídeos N- formil metionil de que reconhecem padrões moleculares que não fazem parte das células dos animais.
TLR - (Toll like receptor)
Lipopolissacarídeos (LPS) são moléculas liberadas por bactérias invasoras que em quantidades mínimas sinalizam precocemente uma infecção e preparam o sistema imunológico para neutralizar futuras infecções. Eles também podem levar à síndrome do choque séptico fatal se a resposta inflamatória for amplificada e não controlada. LPS é um glicolipídeo (Figura 3.1) localizado na membrana externa de bactérias Gram-negativas. É composto por um componente lipídico A anfipático e polissacarídeos hidrofílicos do núcleo e antígeno O. O lipídio A representa o padrão molecular conservado do LPS e é o principal indutor das respostas imunológicas ao LPS. Os receptores TLR-4 são associados ao fator de diferenciação mielóide 2 (MD-2) são ativados por lipopolissacarídeo: o TLR4 associado ao MD-2 é responsável pelo reconhecimento do LPS. Até agora, dez membros da família TLR, reconhecendo uma ampla variedade de produtos microbianos, foram identificados em humanos. Os domínios extracelulares dos TLRs consistem em repetições ricas em leucina (LRRs) com uma forma semelhante a uma ferradura formando um complexo TLR4 – MD-2 – LPS (Figura 3.2). A ligação de ligantes agonísticos causa dimerização dos domínios extracelulares e acredita-se que desencadeie o recrutamento de proteínas adaptadoras específicas para os domínios intracelulares, iniciando assim uma cascata de sinalização. O LPS é extraído da membrana bacteriana e transferido para TLR4 – MD-2 por duas proteínas acessórias, proteína de ligação a LPS e CD14. O heterodímero TLR4 – MD-2 tem especificidade de ligante. Pode ser ativado por moléculas de LPS estruturalmente diversas, e alterações aparentemente menores em derivados sintéticos de LPS podem abolir sua potência endotóxica.
Tabela 3.1. Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs) reconhecidos pela famílias de receptores Toll like (TLRs)
O que acontece após o reconhecimento? Espera-se uma resposta efetiva como fagocitose e destruição do patógeno. Isso só é possível se a sinalização intracelular conectada aos receptores for bem interpretada. Na verdade nem sempre funciona muito bem: o reconhecimento de Leishmania via TLR-4 e TLR-2 por exemplo induzem um processo inflamatório que favorece o parasito. O estudo de como a sinalização é processada internamente pelas células de reconhecimento da defesa inata abre novos horizontes para entender e combater novos e velhos patógenos.
O receptor uma vez ocupado pelo ligante (PAMP) sinaliza para o interior celular onde ocorre um fluxo de informação através do recrutamento de proteínas adaptadoras e proteínas quinases que são ativadas desencadeando a ativação de fatores de transcrição (NF-𝜿B ou IRF-3) que vão promover a transcrição de genes levando a produção de citocinas inflamatórias (TNF, IL-1, IL-12) quimiocinas (IL-8, MCP-1, RANTES), moléculas de adesão celular (E-selectina), moléculas coestimuladoras (CD80, CD86) e citocinas antivirais (IFN-α e IFN-β).
A produção e liberação IL-12 pelos fagócitos, após reconhecimento de um PAMP, estimulam os linfócitos NK: a ligação da IL-12 com receptor de IL-12 estimula o NK a liberar interferon que são sinalizadores para macrófagos aumentarem seu poder de destruição do patógeno fagocitado. Esta interação é um exemplo de fluxo de informação que melhora a resposta de defesa inata contra microrganismos (Figura 3.3).
Figura 3.3. Interação fagócito e linfócito NK.
Farmacologia da Neuroinflamação: Antibióticos e TLR-4
A neuroinflamação é a resposta do sistema nervoso central a eventos que interferem na homeostase do tecido e representa um denominador comum em praticamente todas as doenças neurológicas. A ativação da micróglia, as principais células imunológicas efetoras do cérebro, contribui para a lesão neuronal pela liberação de produtos neurotóxicos. O receptor Toll-like 4 (TLR4), expresso na superfície da microglia, desempenha um papel importante na mediação da ativação da microglia induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e nas respostas inflamatórias. Os antibióticos fluoroquinolonas (FQ) são compostos que contêm um grupo ceto-carbonil que se liga a íons divalentes, incluindo magnésio. Além de sua atividade antimicrobiana, os FQs são dotados de propriedades imunomoduladoras. Estes compostos interferem na via de sinalização inflamatória TLR4/NF-κB. Ciprofloxacina (CPFX) e levofloxacina (LVFX) ligam-se à região hidrofóbica da bolsa MD-2 e inibem a secreção induzida por LPS de citocinas pró-inflamatórias e ativação de NF-κB na microglia primária. Além disso, esses FQs diminuem a ligação de LPS ao complexo TLR4-MD-2 e a dimerização TLR4-MD-2 resultante em células Ba/F3. Esta é uma nova visão sobre o mecanismo da atividade antiinflamatória de CPFX e LVFX, que envolve, pelo menos em parte, a ativação da via de sinalização TLR4/NF-κB. Esta descoberta pode facilitar o desenvolvimento de novas moléculas direcionadas ao complexo TLR4-MD-2, um alvo chave potencial para controlar a neuroinflamação.
Receptores de linfócitos NK
Receptores NK inibitórios
Todos os receptores inibitórios NK bem definidos contêm em suas caudas citoplasmáticas um ou mais motivos inibitórios à base de tirosina (ITIM) que incluem a sequência de consenso: Ile / Val / Leu / Ser – X – Tyr – X – X – Leu / Val (onde 'X' representa qualquer aminoácido). Após a ligação, os resíduos de Tyr no ITIM são fosforilados (provavelmente pela família Src quinase) e recrutam beta-arrestina 2 (Yu et al., 2008), que medeia a ligação de tirosina fosfatases. O recrutamento das fosfatases para a localização proximal da membrana dificulta ou impede os sinais de ativação.
Inibição mediada por MHC classe I
Os receptores NK podem reconhecer proteínas MHC de classe I "clássicas" e "não clássicas". Receptores para proteínas de classe II do MHC não foram identificados. No entanto, uma vez que as células NK podem interagir com células dendríticas (DC), macrófagos e células B, é possível que também existam receptores NK que reconhecem MHC de classe II. As duas famílias principais de receptores inibitórios específicos do MHC identificados em humanos incluem: a superfamília Ig (que inclui os receptores assassinos e leucocitários semelhantes a imunoglobulina designados como receptores assassinos semelhantes a Ig [KIR] e receptores inibidores leucocitários semelhantes a Ig [LIR], e a superfamília do receptor de lectina do tipo C. Os receptores inibitórios individuais apresentam uma variedade de especificidades em relação às proteínas MHC de classe I. Alguns dos receptores inibitórios NK podem detectar determinantes alélicos compartilhados de proteínas MHC classe I, enquanto outros são capazes de reconhecer um amplo espectro de proteínas MHC classe I.
Uma característica importante de todos os receptores NK inibitórios é que eles são expressos de uma forma variada, de modo que cada célula NK expressam múltiplos receptores em um repertório de combinação complexa que resulta em várias subpopulações de células NK capazes de sentir a perda de até mesmo uma única classe de Proteína MHC I. A compreensão dos eventos regulatórios que levam à aquisição do padrão combinatório do conjunto de receptores inibitórios é um assunto de intensa investigação.
Receptores NK tipo Ig
Esta família de receptores pertence à superfamília Ig e é, portanto, denominada KIRs. Os receptores desta família são codificados por 15 genes e 2 pseudogenes localizados dentro do complexo de receptores semelhantes a leucócitos Ig (LRC), que provavelmente evoluiu por duplicação gênica (Lanier, 2005). Dentre os receptores de células NK, os KIRs constituem a família de receptores mais versátil e polimórfica.
Os KIRs são glicoproteínas transmembranares do tipo I que podem ser divididas em duas subfamílias com base no número de domínios semelhantes a Ig na porção extracelular da proteína. A subfamília KIR3D contém três domínios semelhantes a Ig, enquanto as proteínas KIR2D contêm apenas dois domínios semelhantes a Ig. A família KIR contém receptores inibitórios e ativadores. Os receptores KIR ativadores serão discutidos abaixo. Como mencionado acima, os KIRs inibitórios contêm motivos ITIM em seus domínios citoplasmáticos, que são responsáveis pela entrega do sinal inibitório após a ligação do receptor. Embora todos os KIRs inibitórios interajam com as moléculas MHC de classe I, eles manifestam várias especificidades alélicas. Os receptores KIR3D ligam-se a HLA-A3 e -A11 e algumas proteínas HLA-B com o motivo Bw4, enquanto os receptores KIR2D reconhecem predominantemente os alelos HLA-C (Lanier, 2005). Notavelmente, foi demonstrado que um único aminoácido na posição 80 das proteínas HLA-C determina o reconhecimento das proteínas HLA-C pelo receptor KIR2D apropriado (Mandelboim et al., 1996). Assim, toda a subfamília KIR2D é subdividida em receptores que reconhecem proteínas HLA-C contendo resíduos K ou N na posição 80 (Mandelboim et al., 1996). O fato de que muitos dos alótipos HLA-A e HLA-B não puderam ser reconhecidos por nenhum receptor KIR junto com o reconhecimento de todos os alelos HLA-C pelos receptores KIR2D implica que o HLA-C provavelmente evoluiu para fornecer proteção contra células NK .
Ativação de Receptores NK
Por muitos anos, pensou-se que as células NK eram controladas apenas por mecanismos inibitórios. A morte de células-alvo foi considerada um padrão, resultante da ausência de sinais inibitórios. No entanto, agora está bem estabelecido que as células NK requerem sinais de ativação específicos a fim de exibir atividade de matar. A evidência direta da existência de tais receptores foi fornecida pela primeira vez pelo desenvolvimento de anticorpos monoclonais específicos que bloquearam a morte mediada por NK de muitas linhas tumorais. Em humanos, os principais receptores desencadeadores de NK identificados até agora incluem o NKG2D, CD16 e os receptores citotóxicos naturais (coletivamente denominados NCRs), que incluem NKp46, NKp44 (Vitale et al., 1998) e NKp30. A clonagem molecular dos NCRs revelou que eles não compartilham homologia entre si e apenas um baixo grau de identidade com outras proteínas humanas. Os NCRs representam o marcador de superfície mais específico conhecido hoje para células NK humanas e de camundongo.
Os receptores de ativação são definidos por sua capacidade de mediar diretamente a morte de alvos. No entanto, descobertas recentes demonstram que a ativação de alguns dos receptores desencadeadores de NK, em células NK em repouso, requer a estimulação sinérgica de mais de um receptor. Além disso, acredita-se que alguns receptores NK sirvam como receptores coestimuladores que reduzem o limiar de ativação, mas não podem mediar a lise direta por conta própria.
Ao contrário dos receptores inibitórios que contêm um motivo inibitório em sua cauda citoplasmática, a transdução dos sinais de ativação é mediada pela associação dos receptores de ativação com um motivo de ativação baseado em tirosina imunodominante (ITAM) - proteína adaptadora contendo CD3ζ, FcεRIγ, DAP10 e DAP12 (Lanier, 2003). O fato de esses receptores não sinalizarem através de sua própria cauda, mas sim estarem acoplados a diferentes proteínas adaptadoras, pode fornecer uma maquinaria mais flexível para controlar a atividade de matar em diversas condições fisiológicas (Horng et al., 2007).
Assim, sabemos que a morte de células-alvo por células NK requer não apenas uma redução na expressão de ligantes inibitórios, mas também o aumento da expressão de múltiplos ligantes para os receptores ativadores de NK.
“Crosstalk” e "ménage à trois” celular
Interações entre NK humanas e macrófagos em resposta à infecção por Salmonella
As células NK desempenham um papel fundamental na resistência do hospedeiro a uma variedade de microorganismos patogênicos, particularmente durante os estágios iniciais de infecção. Um estudo revelou uma “crosstalk” entre células NK humanas e macrófagos infectados com Salmonella intracelular onde macrófagos ativam as células NK, resultando na secreção de IFN-γ e na desgranulação. Reciprocamente, a ativação das células NK levou a uma redução dramática no número de bactérias vivas intra-macrofágicas. Foram identificados três elementos na interação de células NK com macrófagos infectados. Primeiro, a comunicação entre as células NK e os macrófagos infectados dependia do contato; o segundo requisito foi a iniciação dependente de IL-2 e/ou IL-15 de células NK para produzir IFN-γ. O terceiro foi a ativação de células NK por IL-12 e IL-18, que foram secretadas pelos macrófagos infectados com Salmonella. Moléculas de adesão e IL-12Rβ2 aumentaram na zona de contato entre células NK e macrófagos, consistente com contato e a ativação NK dependente de IL-12 / IL-18. . Nossos resultados sugerem que, em humanos, a depuração bacteriana é consistente com um modelo que invoca uma "ménage à trois" envolvendo células NK, células secretoras de IL-2 / IL-15 e macrófagos infectados.
Receptores de manose
O receptor de manose é uma lectina de membrana de macrófago bem caracterizada, expressa em macrófagos de tecidos por todo o corpo, mas não em monócitos circulantes. As evidências sugerem fortemente que os receptores de manose desempenham um papel na eliminação de patógenos. O receptor de manose é conhecido por se ligar a microrganismos contendo manose e fucose por domínios de reconhecimento de carboidratos. Muitos trabalhos detalharam o reconhecimento do receptor de manose de leveduras, bactérias e certos protozoários. Além disso, as células COS não fagocíticas ganharam a capacidade de se ligar e ingerir microrganismos após a transfecção com genes do receptor de manose, uma indicação clara de que o receptor de manose é um receptor profissional para fagocitose. O envolvimento e a fagocitose de microrganismos pelo receptor de manose do macrófago estimula ativamente a liberação de produtos secretores, incluindo IL-1, TNFα e intermediários reativos de oxigênio, aumentando ainda mais a depuração do antígeno.
As células dendríticas expressam o receptor de manose e uma lectina de membrana (DEC-205) com semelhanças estruturais e especificidades de ligação àquelas do receptor de manose de macrófago. Esses receptores têm um papel potencial no aumento da captura, processamento e apresentação do antígeno ao sistema de defesa adaptativo pelas células dendríticas.
Proteína de ligação à manose / lectina (MBP / L)
MBP / L é uma proteína sérica solúvel e pertence à família de proteínas da collectina, que está se tornando cada vez mais reconhecida como um componente importante do sistema imunológico não clonal. MBP / L é uma lectina do tipo C que medeia a ligação dependente de cálcio de certos carboidratos. A proteína reconhece resíduos de manose e N-acetilglucosamina em bactérias gram-positivas e negativas, bem como em leveduras e certos parasitas, protozoários, micobactérias e vírus. Atuando em conjunto com uma serina protease associada a MBP (MASP), MBP / L pode ativar a via clássica do complemento clivando as moléculas C4 e C2 gerando complexos C4b2a com atividade C3 convertase. De fato, a interação MBP com E. coli induz a ativação do complemento e lise bactericida. A MBP também pode atuar como uma opsonina, induzindo a deposição de C3b e a eliminação subsequente por células fagocíticas ou independentemente pela ligação a receptores C1q.
Receptores de formil Peptídeos
Formil peptídeos são pequenos peptídeos gerados por uma endopeptidase bacteriana clivagem de proteínas bacterianas dos primeiros aminoácidos, incluindo o grupo metionina modificada por formil. Eles ligam-se a receptores específicos nas células fagocíticas e induzem migração dirigida ou quimiotaxia. Os fagócitos humanos expressam dois receptores de formil peptídeo, FPR (receptor de formil peptídeo) e FPRL1 (receptor 1 semelhante a FPR), ambos de que se acoplam às proteínas G sensíveis à toxina pertussis. O FPR liga-se a formil peptídeos com uma afinidade 1000 vezes maior do que a ligação com FPRL1 e é atribuído à indução de quimiotaxia.